执“上帝之剪”改造生命

    7月21日，国际著名期刊《自然》报道，来自四川大学附属华西医院的卢铀团队，计划于8月份开始，使用CRISPR—Cas9技术修改肺癌患者体内的免疫细胞的基因，使得这些免疫细胞能够恢复识别并杀死癌细胞的能力。据悉，这是世界首个利用CRISPR—Cas9基因编辑技术进行的人体临床试验。
    基因编辑技术可以对特定基因进行插入、敲除、替换等精准操作，使得细菌到高等动物等生物体的各项性状发生改变。目前有3种基因编辑技术，包括锌指核糖核酸酶技术（ZFN）、TALEN技术以及CRISPR—Cas9技术，都可以实现对DNA序列的精准识别与剪切。
    利用CRISPR—Cas9基因编辑技术，研究人员可以不用付出高昂的金钱、精力和时间，就可以轻松实现基因的敲除、修改、敲入等，实现细菌到人类的各项性状的改变，就像是获得了上帝造物的“剪刀”一般。这一改造生命的“魔剪”，到底是来自哪里，又能做些什么？
    ●南方日报记者 李秀婷 通讯员 王宇涵 策划统筹 张志超
    CRISPR—Cas9 细菌免疫的黄金搭档
    研究人员发现，细菌的CRISPR可以被转录成RNA分子，并携带着Cas蛋白“巡逻”。当病毒入侵时，CRISPR会与Cas联手执行“清除任务”。其中，Cas9可以高效地对病毒的DNA双链进行定点剪除，独立完成利用CRISPR序列定位和杀死病毒的任务。
    CRISPR的全称是“成簇规律间隔短回文重复序列”（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats），它是基因组DNA上的一段简单重复的特殊序列，存在于40%的细菌和90%的古细菌的基因组中。自上个世纪80年代末开始，科学家们就陆续在不同的细菌体内发现这一段特殊的DNA序列，后来科学家们又发现，细菌中有的CRISPR序列与某些噬菌体的基因组序列信息高度一致。
    细菌个头虽小，但还是要比病毒大上数百倍，有一类病毒会入侵细菌并在细菌体内繁殖，它们被称为“噬菌体”。噬菌体通过在宿主细菌体内释放自身的DNA信息，并利用宿主的资源实现扩增复制。为什么细菌要在体内保存“死对头”噬菌体的遗传信息？
    谜底在2007年被揭晓。一群在食品公司工作的科学家证明，CRISPR序列的存在与细菌的免疫功能密切相关。在生产酸奶的嗜热链球菌中人工添加一段CRISPR序列，就可以帮助细菌抵挡某种对应病毒的入侵。而且，每当有新的噬菌体入侵，细菌就可以把新入侵者的基因组序列整合保存到自己的CRISPR序列中，这种病毒下次入侵的时候，细菌就可以准确识别出“坏蛋”，并进行剿灭。
    听起来很熟悉，这不就是我们打疫苗来获得免疫力的方式吗？人类为了抵抗病毒细菌入侵进化出了复杂的免疫系统，而小小的细菌通过一小段重复的DNA片段就办到了，不得不令人惊叹。
    细菌有了CRISPR序列，相当于掌握了一份可以随时增加名字的“敌军名单”。但它具体是怎样实现对病毒DNA的精确打击的？在追寻这个问题的过程中，科学家们获得了获取新的基因编辑技术的钥匙。
    研究人员进一步发现，细菌的CRISPR序列在正常情况下可以被转录成RNA分子，并携带着一个蛋白复合体“杀手”，在细胞中四处游荡。这些蛋白质复合体“杀手”就是Cas蛋白，在很多细菌中都可以“出现”，而切割修饰核酸以杀死细菌是它们的“祖传绝活”。具体做法就是：病毒入侵，当CRISPR RNA分子识别出这个病毒的基因序列与自身一致后，Cas蛋白复合体就能立即“一刀剪断”病毒的DNA双链，以杀死病毒。
    在这个过程中，Cas内切酶家族与CRISPR合作，在执行杀死病毒的任务——免疫功能时，往往需要“派出”多种蛋白形成蛋白复合体“抱团作战”。但是家族中的“九弟”Cas9特别骁勇善战，在很多细菌的细胞内，Cas9可以高效地对病毒的DNA双链进行定点剪除，能独立完成利用CRISPR序列定位和杀死病毒的任务。
    南方医科大学基础医学院教授赵小阳告诉记者，在CRISPR/Cas系统中，CRISPR区域的第一个重复序列上游，有一段前导序列来启动后续CRISPR序列的转录，并最终形成嵌合RNA分子，即单向导RNA，Cas9内切酶通过向导RNA分子的引导，才能对特定位点的DNA进行切割，形成DNA双链断裂，完成基因定向编辑等的各类操作。
    这就意味着，如果人工编辑CRISPR RNA，就可以让Cas9切割任意指定的DNA。因此，CRISPR—Cas9这一黄金搭档吸引了研究人员最多的关注：是否可以利用CRISPR加Cas9的组合进行基因的精准编辑？
    仅需两天即可构建向导RNA载体
    实验证明，哺乳动物和植物都可以使用CRISPR—Cas9技术进行遗传学改造。科学家们利用CRISPR技术，可以方便地为各种人类疾病构建出动物模型，将大大促进对各种基因疾病的研究。
CRISPR—Cas9在细菌之外的其他生物体内是否同样具有威力？答案是肯定的：在多种类型的细胞和生物体内，CRISPR—Cas9能够正常行使功能，在完整基因组上的特定位点完成切割，也就是说，哺乳动物和植物都可以使用这种技术进行遗传学改造。
    在人类身上呢？答案同样充满惊喜：多个课题组开展的多项研究都表明这种RNA介导的Cas9系统在人类细胞中同样能正常发挥作用。据报道，科研人员在包括诱导多能干细胞在内的多种人体细胞内利用CRISPR—Cas9系统进行基因敲除，成功率高达38%，而且这种Cas9内切酶对细胞几乎没有毒性。
    在CRISPR—Cas9之前，人类已经发展出了几种基因编辑技术，每一个都备受瞩目。其中包括了“大哥”ZNF（锌指核糖核酸酶技术）和“二哥”TALEN蛋白。锌手指蛋白最早发现于非洲爪蟾的细胞，它们被用来定位基因组序列并启动特定基因的转录和蛋白质合成；而TALEN蛋白来自一类特殊的植物细菌——黄单胞菌，其功能也是被用来定位基因组序列，被细菌用来启动它所寄居的植物细胞的基因转录。这两种蛋白都可以与一种叫做FokI的核酸酶合作，实现对基因的定位和剪切修改。
    但CRISPR—Cas9甫一问世，上述两种基因编辑技术迅速“黯然失色”。相比起锌手指蛋白和TALEN蛋白，CRISPR—Cas9技术更易于操作，成本更低。赵小阳介绍，使用CRISPR—Cas9技术只需要针对靶位点人工设计合成一小段DNA，并构建向导RNA载体，2天时间即可。之后再将两个质粒转染进入细胞，如果需要敲除2个基因位点，CRISPR只需再多转染1个质粒就行了，“无论是ZFN还是TALEN都需要针对不同靶点改变核酸酶前面的识别序列，这些识别序列的合成或组装耗时耗力且费用很高，因此CRISPR—Cas9自问世以来受各大实验室科研工作者的喜爱。”他表示。
    《自然》杂志今年3月梳理了人们如何利用CRISPR技术快速改写生命：有对病毒具有抗性的基因编辑猪、能够抵抗引起昏睡病的锥虫的基因编辑牛；通过改造害虫基因可控制病原媒介，如使得所有雌蚊变得不育来对抗登革热、寨卡等蚊媒病的传播等……其中最有价值的应用或许是使用CRISPR技术为各种人类疾病构建出动物模型，例如改变雪貂对流感病毒的易感性，使其成为感染性疾病研究者需要的动物模型。
    全球首例修改人体基因对抗癌症
    由于CRISPR-Cas中充当“向导”的RNA片段与目标DNA只依赖与20个核苷酸进行匹配，所以可能会导致产生目标位点外的切割，出现“脱靶”。如果在基因编辑时因脱靶而修改了其他关键基因，理论上有引起其他疾病的可能。
    从细菌到除人类外的各种哺乳动物，CRISPR一直都显示着良好的实验室乃至现实的应用能力，但涉及人类自身，因为伦理争议，每一步都必须走得很谨慎。
    2015年初，中山大学学者黄军就利用CRISPR/Cas9技术对一组人类受精卵的特定基因进行修改，从而避免该基因突变导致地中海贫血，成为全球首例对人类胚胎的基因编辑，即引发了全世界的争议；今年4月，由广州医科大学附属第三医院范勇研究团队，完成全球第二例人类胚胎基因编辑,使用了不能正常发育的三倍体人类胚胎，来小心翼翼地避开伦理问题。
    华西医院的卢铀团队将开展全球首次CRISPR人体试验的消息，引起全球的广泛关注。据悉，该团队将从恶性非小细胞癌患者中分离免疫T细胞，于体外敲除免疫T细胞的PD—1基因，并在体外对这些改造过的T细胞进行扩大培养。当达到一定量后，将它们输回患者体内，以期能对肿瘤进行杀伤。
    赵小阳介绍，PD—1是T细胞上的程序性死亡受体，而PD—L1是细胞程序性死亡的配体，一旦二者结合，就会启动程序使得T细胞失去活性，这一机制的正常功能是防止免疫细胞过于活跃而攻击自身细胞，出现红斑狼疮等自身免疫疾病。癌细胞正是利用这个系统，在各种肿瘤组织中表达配体PD—L1，触发了T细胞凋亡的机制，从而躲过T细胞的查杀。
    阻断PD—1与PD—L1的结合，就能使得免疫细胞恢复攻击癌细胞的能力。目前市场上著名的免疫抗癌药物PD—1抑制剂就是利用这个原理研制而成。而此次华西医院的研究，抗癌原理与PD—1抑制剂类似，只是后者是使用药物暂时抑制了PD—1的信号，而前者是把病人免疫细胞上的PD—1彻底去除。
    虽然这一抗癌思路可行，但在人体上的实际效果如何，临床试验是否对人体安全，也引发了不少业内专家的担心。赵小阳表示，彻底敲除了PD—1之后，有两个问题随之而来。
    第一个问题就是PD—1失效带来的副作用。赵小阳表示，不同免疫细胞擅长清除不同的东西，人体内只有极少的免疫细胞有清除癌细胞的能力，而有的免疫细胞甚至还能攻击正常细胞，只是平时被PD—1信号抑制住了。因此，一旦全面去除PD—1信号，一些免疫细胞会开始攻击癌细胞，另一些免疫细胞则会开始攻击正常细胞，“掌握好这个平衡很重要。”
    对这个问题，卢铀团队也公开表示，目前处于试验的初级阶段，重心不是解决抗癌问题，而是保证安全问题，所以将会控制移植的细胞数目并通过设置梯度进行试验。
    另一个就是CRISPR自身存在脱靶的问题。赵小阳介绍，由于CRISPR—Cas中充当“向导”的RNA片段与目标DNA只依赖与20个核苷酸进行匹配，所以可能会导致产生目标位点外的切割，出现脱靶效应。
    赵小阳表示，CRISPR的脱靶性到目前为止还无法准确预测，仍在研究。“虽然概率不高，但如果敲除PD—1基因的时候由于脱靶而修改了其他关键基因，理论上有引起其他疾病的可能性。”
    目前，不少科学家都在研究如何克服CRISPR—Cas9的脱靶效应，未来若能很好地解决这一问题，将大大拓展这一基因编辑技术的应用范围。

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